胰岛细胞糖尿病模型构建实验流程

一、实验准备

（一）细胞来源

选用大鼠胰岛素瘤细胞（INS-1细胞），从细胞库购买，复苏后在含10%胎牛血清、1%双抗（青霉素-链霉素混合液）、10mmol/L HEPES、50μmol/L 2-巯基乙醇的RPMI 1640培养基中，于37℃、5% CO₂培养箱中培养，待细胞融合度达80%-90%时传代。

（二）试剂与材料

1. 试剂：链脲佐菌素（STZ）、二甲基亚砜（DMSO）、磷酸盐缓冲液（PBS）、CCK-8试剂盒、胰岛素检测试剂盒、葡萄糖。

2. 材料：96孔板、24孔板、细胞培养瓶、移液枪及枪头、离心机、酶标仪、二氧化碳培养箱、倒置显微镜。

（三）溶液配制

1. STZ溶液：用无菌PBS将STZ配制成20mmol/L的母液，因STZ不稳定，需现用现配，用DMSO助溶，再用PBS稀释，避光置于冰上。

2. 高糖培养基：在基础培养基中加入葡萄糖，使其终浓度达到30mmol/L，模拟高糖环境。

二、实验步骤

（一）细胞接种

1. 取对数生长期的INS-1细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，含10%胎牛血清的培养基终止消化，1000rpm离心5min收集细胞。

2. 用基础培养基重悬细胞，计数后调整细胞密度为5×10⁴个/mL。

3. 在96孔板中每孔加入100μL细胞悬液（5×10³个细胞/孔），24孔板每孔加入500μL细胞悬液（2.5×10⁴个细胞/孔），置于培养箱孵育24h，让细胞贴壁。

（二）STZ诱导处理

1. 24h后，观察细胞贴壁良好，吸去96孔板和24孔板中的原培养基，用PBS轻轻洗涤细胞2 - 3次，去除残留血清。

2. 对于96孔板，每孔加入不同浓度（0mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L ）的STZ溶液100μL，每个浓度设置6个复孔；24孔板每孔加入500μL浓度为15mmol/L的STZ溶液（预实验确定的最佳诱导浓度） ，同时设置正常对照组（加入等体积不含STZ的高糖培养基）。

3. 将培养板放回培养箱，孵育24h。

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